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ELISA的基本原理:
(1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學活性;
(2)抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物,而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性;
(3)酶結合物與相應抗原或抗體結合後,可根據加入底物的顔色反應來判定是否有免疫反應的存在,而且顔色反應的深淺是與标本中相應抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。
    由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上,因而,具有特異性。而另一方面又由于酶标記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結合物,它可以催化底物分子發生反應,産生放大作用,正因爲此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此,ELISA法是一種既敏感又特異的方法。
ELISA的操作要點:
    優質的試劑,良好的儀器和正确的操作是保證ELISA檢測結果準确可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,國内醫學檢驗一般均用闆式點。本文将叙述闆式ELISA各個操作步驟的注意要點,珠式、管式及磁性球ELSIA,國外試劑均與特殊儀器配合應用,兩者均有詳細的使用說明,嚴格遵照規定操作,必能得出準确的結果。
    一、标本的采取和保存
    可用作ELISA測定的标本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排洩物(如尿液、糞便)等均可作标本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些标本可直接進行測定(如血清、尿液),有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清爲标本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。制備血漿标本需借助于抗凝劑,而血清标本隻要待血清自然凝固、血塊收縮後即可取得。除特殊情況外,在醫學檢驗中均以血清作爲檢測标本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清标本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP爲标記的ELISA測定中,溶血标本可能會增加非特異性顯色。
血清标本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有内源性HRP,也會産生假陽性反應。如在冰箱中保存過久,其中的可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來,在5天内測定的血清标本可放置于4℃,超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解後,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻宜輕緩,避免氣泡,可上下颠倒混和,不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉澱的血清标本應先離心或過濾,澄清後再檢測。反複凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清标本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作,也可加入适當防腐劑。
    二、試劑的準備
    按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應爲新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
    三、加樣
    在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加标本,加酶結合物,加底物。加樣時應将所加物加在LEISA闆孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可産生氣泡。加标本一般用微量加樣器,按規定的量加入闆孔中。每次加标本應更換吸嘴,以免發生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可在闆孔中加入稀釋液,再在其中加入血清标本,然後在微型震蕩器上震蕩1分鍾以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。
    四、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,即加标本和加酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱爲溫育(incubation),有人稱之爲孵育,在ELISA中似不恰當。
    ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合隻在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法爲例,加入闆孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,隻有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶标記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是爲什麽ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
    溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,也是大多數抗原抗體結合的合适溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,實驗表明,兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時,産物的生成可達頂峰。爲加速反應,可提高反應的溫度,有些試驗在43℃進行,但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更爲徹底,在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜,以形成最多的沉澱。但因所需時間太長,在ELISA中一般不予采用。
    保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,一般均采用水浴,可将ELISA闆置于水浴箱中,ELISA闆底應貼着水面,使溫度迅速平衡。爲避免蒸發,闆上應加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋闆孔,此時可讓反應闆漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA闆應放在濕盒内,濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,最後将ELISA闆放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度,特别是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育,反應闆均不宜疊放,以保證各闆的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應,操作時的室溫應嚴格限制在規定的範圍内,标準室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,ELISA闆隻要平置于操作台上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準确。爲保證這一點,一個人操作時,一次不宜多于兩塊闆同時測定。

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